Probes for reactive oxygen species（活性氧ROS探針）技術(shù)專題
Aminophenyl fluorescein (APF) 氨基苯基熒光素
Hydroxyphenyl fluorescein (HPF) 羥苯基熒光素
專題關(guān)鍵詞：
Aminophenyl fluorescein (APF)；Hydroxyphenyl fluorescein (HPF)；Reactive oxygen species (ROS) 活性氧物質(zhì)；DCFH-DA；CAS：359010-69-8；
基本描述：
氨基苯基熒光素（APF）和羥苯基熒光素（HPF）是由T. Nagano開發(fā)的兩種活性氧（Reactive oxygen species, ROS）指示劑，比H2DCFDA（DCFH-DA, DCFH）具更的特異性和穩(wěn)定性。APF和HPF顯示有限的非選擇性反應(yīng)，和相對(duì)較高的光誘導(dǎo)氧化抗性。APF和HPF具細(xì)胞膜滲透性，本身無熒光，直到與羥基自由基或過氧亞硝基陰離子反應(yīng)，還能與次氯酸陰離子反應(yīng)，產(chǎn)生強(qiáng)綠色熒光（Ex/Em，~490/515nm），可用熒光顯微鏡、高通量成像儀、熒光酶標(biāo)板或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
工作原理：
中性溶液中氨基苯基熒光素（APF）和羥苯基熒光素（HPF）幾乎是無熒光，當(dāng)與高活性氧物質(zhì)（highly reactive oxygen species, hROS）反應(yīng)，能夠生成具有高熒光強(qiáng)度的熒光素（Ex/Em, 490/515nm），且能觀察到熒光強(qiáng)度的增加【見下反應(yīng)原理圖】。
探針特征：
□ APF，HPF選擇性檢測(cè)hROS比如羥基自由基（HO•）和過氧亞硝基陰離子（ONOO–），但不會(huì)與其他活性氧物質(zhì)反應(yīng)（•O2–,1O2, H2O2, NO等）；
□ 通過加入辣根過氧化物酶（HRP）能定量測(cè)定過氧化氫H2O2;
□ 結(jié)合使用HPF和APF能特異性檢測(cè)次氯酸（OCl-）;
□ HPF和APF本身根本不會(huì)自氧化，從而與其他試劑相比能得到更可靠的數(shù)據(jù)；
□ 能對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行成像檢測(cè)；
ROS探針檢測(cè)特異性比較：
□ 試劑配制：1mg HPF/APF分別溶于DMF配制成5mM儲(chǔ)存液。使用前用磷酸鹽溶液（0.1M, pH 7.4）稀釋500~5000倍（10～1μM）。將稀釋液加入樣本并孵育，然后測(cè)定熒光值（Ex/Em, 490/515nm）。
□ 磷酸鹽緩沖液體系（0.1M, pH 7.4），每一種熒光試劑（終濃度：10mM，0.1% DMF用作共溶劑）與各種活性氧物質(zhì)反應(yīng)。
□ HPF（Ex/Em=490/515nm）, APF（Ex/Em=490/515nm）, DCFH（Ex/Em=500/520nm）的熒光強(qiáng)度測(cè)定。
表1. 活性氧探針（HPF, APF, DCFH）對(duì)各種活性氧物質(zhì)的反應(yīng)特異性
ROS | HPF (MX4805-1MG) | APF (MX4804-1MG) | DCFH (MX4802-50MG) |
HO• | 730 | 1200 | 7400 |
ONOO– | 120 | 560 | 6600 |
OCl- | 6 | 3600 | 86 |
1O2 | 5 | 9 | 26 |
•O2– | 8 | 6 | 67 |
H2O2 | 2 | ＜1 | 190 |
NO | 6 | ＜1 | 150 |
ROO• | 17 | 2 | 710 |
Autoxidation | ＜1 | ＜1 | 2000 |
ROS探針應(yīng)用示例：
示例1：細(xì)胞經(jīng)光誘導(dǎo)的自氧化檢測(cè)（Light-induced autoxidation in cells）
1.1 探針加量：37℃避光孵育細(xì)胞30min，HPF或DCFH-DA（10mM each）
1.2 熒光測(cè)定：共聚焦顯微鏡觀察熒光（激發(fā)波長(zhǎng)488nm，檢測(cè)波長(zhǎng)＞515nm）；488nm波長(zhǎng)輻射刺激細(xì)胞10s，然后再測(cè)定熒光。
1.3 實(shí)驗(yàn)圖片：
示例2：豬中性粒細(xì)胞的體內(nèi)成像（Bioimaging of porcine neutrophils）
2.1 豬中性粒細(xì)胞的純化
a）從豬血中純化中性粒細(xì)胞；b）將純化的中性粒細(xì)胞溶于KRPD緩沖液（Krebs-Ringer phosphate buffer）(114 mM NaCl, 4.6 mM KCl, 2.4 mM MgSO4, 1.0 mM CaCl2, 15 mM NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7.4)，置于冰上直至使用。將其轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿內(nèi)。
2.2 探針加載與PMA刺激
a）加10mM HPF或APF到細(xì)胞，室溫孵育30min。b）加入佛波酯PMA（2ng/ml）刺激中性粒細(xì)胞；
2.3 中性粒細(xì)胞的體內(nèi)成像
刺激前或刺激后10min用共聚焦顯微鏡觀察中性粒細(xì)胞（激發(fā)波長(zhǎng)488nm，觀察波長(zhǎng)505nm-550nm）。
產(chǎn)品信息：高品質(zhì)產(chǎn)品，現(xiàn)貨供應(yīng)，咨詢，maokangbio內(nèi)容。
貨號(hào) | 名稱 | 規(guī)格 | 價(jià)格（元） |
MX4804-1MG | Aminophenyl fluorescein (APF) 氨基苯基熒光素 | 1mg | 2080 |
MX4805-1MG | Hydroxyphenyl fluorescein (HPF) 羥苯基熒光素 | 1mg | 2080 |
MX4802-50MG | H2DCFDA (DCFH-DA, DCFH) 活性氧（ROS）熒光探針 | 50mg | 546 |
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相關(guān)產(chǎn)品：ROS研究常用的配套產(chǎn)品，需要了解更多信息咨詢，maokangbio內(nèi)容。
貨號(hào) | 名稱 | 規(guī)格 | 價(jià)格（元） |
MX4801-1KIT | Reactive Oxygen Species (ROS) Assay Kit 活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒 | 100~500T | 328 |
MZ2401-100UL | PMA (TPA, 5mg/ml)佛波肉荳蔻醋酸（5mg/ml） | 100μl | 280 |
MS5603-50ML | tert-Butyl hydroperoxide solution (TBHP) 叔丁基過氧化氫溶液 | 50ml | 98 |
MP5429-10MG | N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) N-甲酰-蛋氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸 | 10mg | 588 |
M36008（Invitrogen） | MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator | 50 µg | 650 |
注意事項(xiàng)
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
— —Written/Edited by V. Shallan【版權(quán)歸MKBio懋康所有】
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